张美玲：17分钟讲述如何“养好肠道，养好鱼”
各位同行大家好，我是来自华东师范大学生命科学学院的张美玲。
非常感谢《肠·道》的邀请，能有机会和大家一起分享，我们实验室近几年在肠道菌群与水产动物营养方面开展的工作。
本演讲的幻灯片 .pdf 版将在热心肠菌群微信群分享，感兴趣的读者请按以下方法申请入群：
我国是世界上主要的水产品生产国之一，水产品总量自 1989 年起连续 30 年居世界首位，占到世界总产量的 2/5 以上。2019 年水产品总量达到了 6450 万吨。
其中我们可以看到，从 2011 年到 2019 年，捕捞量的总比例在不断下降，而养殖量的总比例是逐年上升。所以，水产养殖业是我们日常生活中水产品的重要供给来源，而其中鱼类养殖约占水产养殖总量的 54%。
但是在水产养殖中，我们也面临着很多的问题。
比方说，由于海洋捕捞的资源有限，鱼粉的价格不断攀升，我们需要利用其它的蛋白源，包括昆虫粉、羽毛粉或者是植物蛋白，来替代鱼粉。而饲料原料的替代不当，就会导致鱼类健康受损、抗病力下降。
其次，高密度、集约化的养殖条件，在提高产量的同时，也增加了水产动物的应激，导致动物的抗病力下降。疾病的发生已经成为限制鱼类养殖业健康蓬勃发展的一大障碍。
在水产养殖中，细菌性疾病的经典治疗方法就是使用抗生素。但是，抗生素的大量使用会破坏生态环境，导致抗生素残留以及耐药菌株的产生。
我们实验室之前的工作发现，即使是环境浓度的抗生素依然会对鱼体的健康产生影响。
2019 年 7 月 9 日，我国农业农村部发布了第 194 号公告，明确要求 2020 年 1 月 1 日起，退出除中药以外的所有促生长类药物饲料添加剂的品种。
养殖业禁抗已成为大势所趋。如何在高密度、集约化的养殖条件下，提高鱼体的免疫力和抗病力，就显得尤为重要。
俗话说：“养好肠道养好鱼”。肠道健康在鱼类的健康养殖中，发挥着重要的作用。
作为鱼类重要的消化吸收器官，肠道通过对营养物质的消化和吸收，影响鱼类的生理代谢；而作为鱼类重要的内分泌器官和免疫器官，肠道也参与了抗菌肽和摄食调控类激素的分泌。
此外，肠道还是非常重要的物理屏障，可以抵抗病原微生物和食物中抗原对于机体的影响。
肠道中定植着大量的微生物，而这些微生物也会通过自身的细胞组分或者是代谢产物，影响鱼类的营养代谢、系统发育、免疫调节等生理过程。
与高等动物相比，鱼肠道微生物有它自己的特点。
首先，鱼类的繁殖是体外受精，所以环境微生物的组成对鱼肠道微生物组成的影响会更大。
其次，鱼肠道中的优势菌主要是变形菌门和梭杆菌门，而并非我们非常熟悉的高等动物中的厚壁菌门和拟杆菌门。
在高等动物中的研究已经表明了，肠道微生物与宿主脂肪沉积有着密切的关系，可能的机制也不尽相同。比方说，增加能量的摄取或者是引发慢性的炎症。
在鱼类中，高脂饲料饲喂也会导致鱼体出现脂肪沉积。相比于哺乳动物，鱼类的进化地位更低，生活环境与陆生动物也迥然不同，所以，如果能在鱼类中发现肠道微生物促进宿主能量储存的机制，无疑具有非常重要的意义。
因此，我们提出两个问题，首先，高脂饮食是否会对鱼肠道微生物产生影响？第二，肠道微生物在鱼体的脂肪沉积中的作用，是否具有物种的普遍性？
为了解决这些问题，我们首先以高脂饲料来饲喂尼罗罗非鱼 8 周，之后从罗非鱼的肠道中筛选到一株可以显著降解油脂的细菌。通过系统进化分析，我们发现这株菌属于柠檬酸杆菌属。
为了研究该菌的生物学效应，我们把它以一定的浓度添加到了对照组饲料和高脂饲料中，饲喂罗非鱼 8 周。之后，我们检测鱼体的生长及生理指标、代谢指标以及肠道微生物的组成。
对四个处理组的罗非鱼肠道中的柠檬酸杆菌进行一个定量分析，我们会发现，高脂饲料可以显著地提高鱼肠道中柠檬酸杆菌的丰度；而高脂加菌组则会让这个丰度进一步地增强。
既然这个目标菌被高脂饲料富集，我们就很想知道，这个菌会不会让摄入高脂饲料的罗非鱼变得更胖呢？
通过体重以及总脂的检测，我们会发现，高脂加菌组与其它组相比，体重是明显增加的，而且体脂的含量也显著增加。
既然总脂的含量增加了，接下来我们就在想，这些增加的脂肪到底储存在了哪里？
在鱼体中，肝脏和腹腔脂肪是两个非常重要的脂肪沉积部位。
我们首先对肝脏的脂肪进行一个检测，发现高脂饲料的饲喂可以提高罗非鱼的肝脂；但是，高脂饲料与目标菌的联合施用，并没有进一步加剧鱼体的肝脂积累。HE 的染色也同样地证明了这个结果。
接下来我们就看一下，高脂饲料与目标菌联合施用的时候，鱼体的腹腔脂肪情况。
通过脂体比的数据，我们会发现，高脂饲料可以让罗非鱼变得更胖，而高脂加菌会让它的腹腔脂肪指数进一步地升高。我们对腹腔中的脂肪进行了一个切片分析，可以发现，高脂加菌组鱼体腹腔的脂肪细胞的体积是显著增加的。
接下来我们就想知道，目标菌为什么会让高脂饲料饲喂的罗非鱼更胖呢？
我们用豆油给罗非鱼灌胃，并在 90 分钟以后检测它肠道以及血清中的甘油三酯和游离脂肪酸的含量。结果发现，高脂加菌组肠腔内的游离脂肪酸是显著降低的，而它的血清中游离脂肪酸的含量有上升趋势。
这也就提示我们，鱼体对于食物中摄入的甘油三酯的转运速率是不是加强了？
通过定量检测脂转运相关的基因和蛋白，我们发现高脂加菌组的 ApoB（载脂蛋白 B）的含量以及和脂转运相关的一些基因表达水平是显著上升的。这说明，目标菌的添加提高了鱼肠道对食物中甘油三酯的吸收和转运的速率。
此外，我们还利用了 FITC 标记的葡聚糖以及尤斯室，在体内和体外检测鱼肠道的通透性。结果发现，目标菌的添加增加了罗非鱼的肠道通透性。
接下来我们就想知道，高脂以及加菌以后引起的鱼体代谢表型到底是目标菌的直接效应，还是由整体的菌群变化引起的？
所以我们对样品进行了一个高通量的测序。测序结果表明，即使是在饲料中加入目标菌进行投喂，这个菌依然不是罗非鱼肠道的优势菌种，但是它却显著地改变鱼肠道整体的微生物组成。
所以我们推测，高脂加菌所导致的罗非鱼脂肪沉积的表型，是由于目标菌加入以后引发的菌群整体变化引起的。
为了验证这一个假说，我们将目标菌以及不同处理组的罗非鱼肠道微生物，移植到无菌斑马鱼肠道中。通过检测我们发现，高脂加菌组的肠道内容物可以显著地提高斑马鱼腹腔脂肪的沉积情况。
肠道菌群以及肠道菌群与宿主的互作，是一个非常复杂的生态系统。很多研究往往关注肠道内优势菌的功能和作用，并将某种菌在肠道菌群中是否具有优势地位，作为它是否发挥重要功能的依据之一。
那么我们这个工作就发现，罗非鱼肠道内的非优势菌，比如说这里的柠檬酸杆菌，它可以通过影响鱼肠道整体的菌群组成，进而影响罗非鱼的能量收支平衡和脂肪沉积情况。
这个工作也就证实了，非优势菌群在肠道微生态的平衡中，也具有非常重要的作用。
肠道中还有很多的细菌对宿主的健康是有利的，也就是大家非常熟悉的益生菌。世界卫生组织在 2001 年，就对益生菌进行了一个明确的定义。
近年来，益生菌在人类营养和畜禽养殖中广泛地使用。大量的研究表明，益生菌具有预防和治疗多种疾病的功效。但是，益生菌的使用也存在一些局限性，比如说菌种的活性问题、耐药性的问题。
近些年还有一个新的概念出现，那就是后生元。后生元是益生菌经过加工处理以后的益生成分的统称，包括菌体或者是它的代谢产物。
有研究已经表明，经过筛选的后生元仍然可以保持高度的生理活性。如果我们可以确定某些益生菌的功能因子，对于后生元的开发也具有重要的意义。
接下来，我就介绍一下，我们实验室在鱼用益生菌机制探索中的工作。
碳水化合物是鱼类重要的代谢功能底物之一，也是水产饲料中较为廉价的能量来源。
但是与高等动物相比，鱼类对于碳水化合物的消化吸收效率是非常低的。长时间摄入高碳水化合物水平的饲料，会导致鱼体出现生长受阻、饲料利用效率较低、脂肪异常沉积、甚至高死亡率等营养性病害问题。
“鱼类为什么不能很好地利用糖类物质”已经入选了《10000 个科学难题》。
无论是我们自己的工作，还是同行的工作，都已经表明肠道微生物与碳水化合物代谢密切相关。
因此，是否可以通过调节肠道微生物的组成，来提高鱼类对于碳水化合物的利用效率呢？这个问题的答案对于水产养殖业意义重大。
我们以不同的碳水化合物来作为碳源，培养罗非鱼肠道中的微生物。最终筛选到一株具有高淀粉酶活性、体外发酵产生短链脂肪酸——尤其是乙酸的细菌。经过系统进化分析，该菌株与解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系是比较近的。
为了检测在水体中添加目标菌的时候，它是不是可以成功地抵达肠道，我们借助了 D 型丙氨酸标记技术来检测目标菌。
结果发现，即使是水体添加，该菌还是可以成功地在鱼肠道中被检测到的。
为了研究该菌株在罗非鱼体内的生物学效应，我们将它以一定的浓度加入到养殖水体中。所以这一轮的养殖实验一共分为三组，分别是正常饲料组、高碳水化合物饲料组以及高碳水化合物饲料添加目标菌组。
在经过 10 周的养殖之后，我们发现，高碳水化合物饲料可以提高罗非鱼的体重，而高碳水化合物添加细菌可以让它的体重增加的更多，饲料的利用效率也更高。
正如我们之前所说，鱼类对于高碳水化合物的耐受程度不高，那么我们这个目标菌的添加是否可以提高鱼的糖耐受能力呢？
通过检测空腹血糖和糖耐受实验，我们发现，高糖组——也就是高碳水化合物组，与正常对照组相比，血糖水平是明显提高的；但是，添加目标菌可以显著地降低血糖水平，而且让它这个值趋近于正常对照组。
同时我们还发现，与高糖组相比，加菌组的肝糖原显著地降低，而胰岛素信号通路上相关的蛋白分子也显著提高，说明加菌组的罗非鱼胰岛素的敏感性较高。
除了提高鱼体的糖耐受能力，我们还发现，在高糖饲喂下，鱼的肝脏脂肪出现了很严重的沉积，而 HE 染色和油红染色都表明，目标菌的加入可以缓解这一异常。
同时分子指标也显示，磷酸化的 AMPK 表达量显著增加，说明加入目标菌之后，鱼体的能量动用和消耗是有增加的。
既然和对照组相比高糖加菌组的体重有增加，但是我们并没有发现脂肪蓄积有明显的增加，所以这里问题就来了，这个鱼的增重发生在哪里？
通过检测鱼体可食用部位的重量以及蛋白的含量，我们发现高糖加菌组可以有效地提高鱼体可食用部位的蛋白含量，而且进一步的分子指标也发现，与蛋白合成有关的 mTOR 的磷酸化水平是被显著提高的。
其实这些表型也是水产养殖中非常希望看到的。
为什么高糖加菌组会有这么多的效应？这个效果和肠道微生物有关吗？
接下来，我们就对三个处理组的罗非鱼肠道中微生物的组成进行了分析。结果我们可以看到，高糖组的鱼肠道微生物和对照组是有显著差异的，但是加菌组会让肠道微生物的组成更加趋向于正常对照组。
同时我们对优势的 OTU 进行检测，发现高糖加菌组肠道中，一些和短链脂肪酸产生相关菌的丰度有了明显的上升。
因此，我们对各组的肠道内容物进行了短链脂肪酸组成及含量的检测。结果发现，添加了目标菌会显著地提高肠道中乙酸的含量，乙酸受体的检测也印证了这一假设。
为了进一步确认微生物的代谢产物——乙酸，是不是和鱼类的代谢表型之间存在一个相关性，我们开展了第二轮养殖实验。
在这个实验中，我们利用高碳水化合物来养罗非鱼，同时设置了三个不同浓度的乙酸钠添加组。
经过 8 周的养殖，我们欣喜地发现，一定浓度的乙酸钠添加可以显著地降低鱼体的空腹血糖，以及减少肝脏的脂肪沉积，而进一步的分子指标也印证了我们之前的实验数据。
但是我们也发现，乙酸钠的添加并没有显著提升鱼体的蛋白沉积。这也说明益生菌对于宿主的影响是多因素的，我们还需要不断的探索寻找更多的微生物益生效应分子。
近年来，养殖业中有一个概念是“精准营养”。实现精准营养的前提是，我们对养殖物种在不同的生长阶段、不同的环境条件下以及不同的养殖模式中的营养需求，有一个明确的了解。很多的同行也在开展相关的工作。
而益生菌、益生元或者是后生元，在养殖业中的使用同样需要精准。不同食性的鱼类具有不同的消化道结构，饲料组分以及养殖环境也会影响鱼肠道微生物的组成。
因此，只有在深入了解益生菌产品作用机制的基础上，才能对相关的产品进行有效的开发和使用。
我们也非常希望，在水产动物中揭示微生物的功能，为新的益生菌产品开发奠定基础。
最后我要非常感谢我亦师亦友的合作者——陈立侨教授和杜震宇教授，以及国家自然科学基金、国家重点研发计划对本项目的支持。
今天的分享就到这里。感谢聆听，敬请批评指正。